原代細胞培養(yǎng)技巧和竅門
發(fā)布時間：2023-07-21 瀏覽次數(shù)：1015
原代細胞（Primary cells）是指來源活體組織，經(jīng)過特定分離方法制備而成的初始細胞。
原代細胞離體時間短且不經(jīng)過永生化過程，其生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保持原有的遺傳特征，可更好地反映細胞在體內(nèi)的生長狀態(tài)，從而獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù)，很適合用于藥物測試、細胞分化和轉(zhuǎn)化等實驗研究。
原代細胞培養(yǎng)技巧
1. 生長需求（Growth Requirements）
原代細胞可以懸浮培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)。一些細胞自然地懸浮在懸浮液中，而不附著在表面上（例如，來源于外周血的細胞）。也有一些細胞系經(jīng)過修飾可以在懸浮培養(yǎng)中存活，它們的生長密度高于粘附條件所允許的密度。對于依賴貼壁的原代細胞，貼壁細胞（例如實體組織）需要一個表面才能在體外正常生長。
這些細胞大多在沒有涂層的扁平塑料容器中培養(yǎng)，但有時在微載體上培養(yǎng)，可以用細胞外基質(zhì)蛋白（如膠原蛋白和層粘連蛋白）包被，以增加粘附特性并提供生長和分化所需的其他信號。細胞培養(yǎng)基由補充了適當(dāng)?shù)纳L因子和細胞因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成，細胞在細胞培養(yǎng)箱中生長，并維持在適當(dāng)?shù)臏囟群突旌蠚怏w中（對于哺乳動物細胞，通常為37°C，5％CO?）。培養(yǎng)條件根據(jù)細胞類型而廣泛變化，生長培養(yǎng)基的pH、葡萄糖濃度、生長因子和其他營養(yǎng)物質(zhì)的存在可能會有所不同，具體取決于細胞類型。
在建立原代培養(yǎng)過程中，必須在生長培養(yǎng)基中加入抗生素以抑制從宿主組織引入的污染?？股乜赡馨☉c大霉素，青霉素，鏈霉素和兩性霉素B的混合物。但是，不建議長期使用抗生素，因為某些試劑（例如兩性霉素B）從長期來看可能對細胞有毒。
分離后保留原代細胞的活力非常重要，因為它們中的大多數(shù)會經(jīng)歷衰老過程，并在一定數(shù)量的種群倍增后停止分裂。為了使細胞長期存活，必須具備出色的細胞培養(yǎng)操作技能以及適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件（即生長培養(yǎng)基、溫度、氣體混合物、pH、生長因子濃度、營養(yǎng)物質(zhì)和葡萄糖等）。用于補充培養(yǎng)基的生長因子通常來自動物血液（血液來源的成分具有污染的可能性），建議盡可能減少或消除這些成分的使用，操作時也需要使用無菌技術(shù)。
2. 細胞融合（Cellular confluence）
細胞融合通常是指附著的細胞在培養(yǎng)容器中所占的百分比。例如，100％的細胞融合意味著培養(yǎng)皿表面被細胞完全覆蓋，而50％的細胞融合意味著大約一半的表面被覆蓋。跟蹤和評估原代細胞培養(yǎng)是一個重要且必不可少的參數(shù)，因為各種細胞類型需要不同的融合終點，此時需要對其進行傳代培養(yǎng)。
3. 繼代保持（Maintenance and Subculture）
當(dāng)分離的細胞附著在培養(yǎng)皿表面時，細胞的維持階段開始。通常，培養(yǎng)開始后約需要24小時。當(dāng)細胞達到所需的細胞融合百分比并活躍增殖時，就該進行傳代培養(yǎng)了。這是在達到100％融合之前傳代原代細胞培養(yǎng)的最佳時間，因為融合后的細胞可能會發(fā)生分化，并在傳代后顯示出較慢的增殖。
依附依賴性細胞以單層生長，需要定期用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基傳代培養(yǎng)以維持指數(shù)生長。單層的繼代培養(yǎng)涉及細胞間和細胞內(nèi)表面間鍵的斷裂，大多數(shù)粘附的原代細胞需要消化它們的蛋白質(zhì)附著鍵，或者需要用低濃度的蛋白水解酶（例如胰蛋白酶/ EDTA）從單層或相關(guān)組織中分離出來。細胞解離并分散成單細胞懸液后，將它們計數(shù)并稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?，然后轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)容器中（培養(yǎng)基的組成取決于細胞類型而有所不同），在此處它們會重新附著并分裂。
4. 細胞計數(shù)（Cell counting）
血細胞計數(shù)器通常用于使用排阻染料錐蟲藍估計細胞數(shù)和確定細胞活力。血細胞計數(shù)器是相當(dāng)厚的玻璃顯微鏡載玻片，帶有矩形凹痕，可形成一個腔室。腔室上刻有垂直線的激光蝕刻柵格，并且精心制作了該設(shè)備。由線界定的面積和腔室的深度是已知的。因此，可以對特定體積的流體中的細胞數(shù)進行計數(shù)，從而計算出整個流體中的細胞濃度。
5. 冷凍保存和恢復(fù)（Cryopreservation and Recovery）
低溫保存是使用低溫保存結(jié)構(gòu)完整的活細胞的過程。冷凍保存和融化原代細胞是必不可少的，以最大程度地減少每個過程中的細胞損傷和死亡。對于原代細胞，可通過使用冷凍保護劑（例如DMSO或甘油，在正確的溫度和受控的冷凍速率下）實現(xiàn)。對于大多數(shù)原代細胞，可以在80％完全生長培養(yǎng)基的混合物中添加10％FBS和10％DMSO進行冷凍保存。冷凍過程需要以每分鐘-1°C的速度緩慢進行，以最大程度地減少細胞內(nèi)冰晶的形成。冷凍的培養(yǎng)物需要以液氮（-196°C）或低于-130°C的氣相存儲。
解凍冷凍保存的細胞是快速的過程，方法是將冷凍的細胞浸入37°C水浴約1-2分鐘。注意不要在融化后離心原細胞（因為它們對冷凍保存恢復(fù)過程中的損傷極為敏感）。最好在融化后直接鋪板細胞，并允許培養(yǎng)物在最初的24小時內(nèi)附著。當(dāng)啟動冷凍保存的原代細胞培養(yǎng)時，必須在細胞附著后去除用過的培養(yǎng)基（因為DMSO對原代細胞，并可能導(dǎo)致解凍后活力下降）。
原代細胞培養(yǎng)過程中可能存在的錯誤
污染：轉(zhuǎn)移主要組織進行培養(yǎng)時需要注意避免污染。
pH值變化：這可能是由于培養(yǎng)基中的鹽分不正確，細菌或真菌污染，碳酸氫鹽緩沖液不足，二氧化碳張力不正確等引起的。
粘附性不足（細胞不貼壁）：培養(yǎng)基中不含附著因子（attachment factors）或附著因子不足，培養(yǎng)皿或培養(yǎng)基污染，細胞被胰蛋白酶過度消化等。
生長緩慢：原因包括培養(yǎng)基的pH值變化，必需的促進生長的成分/因子耗盡，低污染，試劑儲藏不當(dāng)?shù)取?/span>
細胞死亡：溫度波動，二氧化碳含量過低，在融化和/或冷凍保存過程中細胞受損，有毒代謝產(chǎn)物濃度增加，培養(yǎng)基中的滲透壓失衡導(dǎo)致細胞存活率降低。
沉淀（pH不變）：由于使用了冷凍培養(yǎng)基，在pH不變的培養(yǎng)基中可能會出現(xiàn)沉淀，殘留的磷酸鹽殘留在用洗滌劑洗滌時可能會沉淀出粉末狀的培養(yǎng)基成分。
細胞結(jié)塊（細胞不貼壁且結(jié)塊）：懸浮細胞可能由于鈣、鎂離子的存在（貫流時應(yīng)使用不含鈣、鎂離子的D-Hank’s緩沖液（D-HBSS），而不能選擇含有鈣、鎂離子的HBSS或可能含有鈣、鎂離子的PBS緩沖液）或細胞裂解及DNA釋放（過度用蛋白水解酶消化）而結(jié)塊。
誘導(dǎo)變異性：多種試劑和培養(yǎng)基會誘導(dǎo)原代細胞的數(shù)據(jù)產(chǎn)生變異，研究者的處理手法也可能導(dǎo)致原代細胞的數(shù)據(jù)產(chǎn)生變異。
來源："東創(chuàng)實驗科研服務(wù)"公眾號
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