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細胞增殖與毒性檢測（CCK8 法）

一、實驗?zāi)康模?/strong>通過檢測細胞活力來驗證目的基因?qū)毎鲋车挠绊?，或驗證某種藥物對細胞的毒性。

二、實驗原理：Cell Counting Kit-8(簡稱 CCK8) 試劑中含有 WST-8。活細胞特別是增殖期細胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能夠使 WST-8 還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，用酶標(biāo)儀在 450nm 波長處測定其吸收值，即可間接反映細胞增殖情況。

三、細胞增殖與毒性檢測（CCK8 法）實驗步驟

1. 將細胞以 104-105 個細胞/孔的密度接種在  96 孔板 中，加入 100μL 培養(yǎng)基，含或不含待測化合物。在 CO2 培養(yǎng)箱中在 37℃ 下培養(yǎng)細胞 24 小時。

2. 向板中加入 10μL 不同濃度的待測物質(zhì)。

3. 在培養(yǎng)箱中將培養(yǎng)板培養(yǎng)適當(dāng)時間（如 6、12、24 或 48 小時）。

4. 向板的每個孔中加入 10μL CCK-8 溶液。小心不要將氣泡引入孔中。

5. 將平板在培養(yǎng)箱中孵育 1-4 小時。

6. 在讀板之前，在定軌振蕩器上輕輕混勻。

7. 使用酶標(biāo)儀測量 450nm 處的吸光度。

四、常見問題及解答

Q1：做細胞活性檢測時，每孔應(yīng)該接種多少個細胞？
A：當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板時，貼壁細胞一般最小接種量為 1,000 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于 2,500 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)，當(dāng)然，也有部分極其靈敏的試劑盒或可檢測更少量的細胞。

Q2：若是使用 6 孔或者 24 孔板進行試驗，CCK 試劑使用量怎么樣呢？
A：如果要使用 6 孔板或 24 孔板實驗，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK8 溶液。

Q3：培養(yǎng)基的本底顏色如酚紅會不會影響細胞活性的檢測呢？
A：不會的，培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光值而消去，因此不會對檢測造成影響。

Q4：只可以在 450nm 波長處測 OD 值嗎？
A：可以在 450nm 波長處測 OD 值，但是若無此波長的濾光片，可選擇吸光度在 430-490 nm 之間的濾光片，但是 450 nm 濾光片的檢測靈敏度最高。

Q5：若是暫不檢測 OD 值，該如何處理？
A：若暫時不測定 OD 值，可以向每孔中加入 10 μL 0.1 M 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24 小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。

Q6：在實驗中 OD 值太高，怎么解決？
A：CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時間由 2 小時縮短為 1 小時。此外，可適當(dāng)減少細胞的數(shù)量。

Q7：應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？
A：建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態(tài)不一定一樣。對于狀態(tài)不一樣的細胞，建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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細胞周期檢測（PI 法）

一、實驗?zāi)康模?/strong>通過檢測細胞內(nèi) DNA 含量的變化，檢測外界干預(yù)手段對細胞生長周期的影響。

二、實驗原理：

細胞周期（cell cycle）：是指細胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，通常由 G0/G1 期、S 期、G2/M 期組成。G0/G1 期：二倍體細胞的 DNA 含量 (2N)。S 期：DNA 開始合成，這時細胞核內(nèi) DNA 的含量介于 G1 期和 G2 期之間。G2/M 期：DNA 復(fù)制結(jié)束成為 4 倍體（4N)。

碘化丙啶 (Propidium, PI)PI 為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸 DNA 或 RNA 雙鏈螺旋的堿基之間，產(chǎn)生紅色熒光，并且熒光強度和所嵌入的核酸含量成正比。細胞周期檢測時，首先用 RNA 酶將 RNA 消化排除影響，通過流式細胞術(shù)檢測 PI 熒光強度直接反映細胞各時相的 DNA 分布狀態(tài)，從而計算出各時相的百分率。

三、細胞周期檢測（PI 法）實驗步驟

1. 細胞樣品的準(zhǔn)備：待各實驗組細胞融合度達到 70%，用胰酶消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000 g 左右離心 3 分鐘，沉淀細胞。小心吸除上清。加入 1 毫升冰浴預(yù)冷的 PBS，重懸細胞，并轉(zhuǎn)移到 1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細胞，避免細胞成團。

對于懸浮細胞：收集細胞到離心管內(nèi)，1000 g 左右離心 3 分鐘，沉淀細胞。小心吸除上清，加入 1 毫升冰浴預(yù)冷的 PBS，重懸細胞，并轉(zhuǎn)移到 1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細胞，避免細胞成團。

2. 細胞固定：加入 1 毫升冰浴預(yù)冷 70% 乙醇，輕輕吹打混勻，4℃ 固定過夜。1000 g 左右離心 3 分鐘，沉淀細胞。小心吸除上清，加入 1 毫升冰浴預(yù)冷的 PBS，重懸細胞。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細胞，避免細胞成團。

3. 碘化丙啶染色液的配制：參考下表，根據(jù)待檢測樣品的數(shù)量配制適量的碘化丙啶染色液，現(xiàn)配現(xiàn)用：

1. 染色：每管細胞樣品中加入 0.5 毫升碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀， 37℃ 避光溫浴 30 分鐘。

2. 流式檢測和分析：用流式細胞儀在激發(fā)波長 488nm 波長處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用分析軟件進行細胞 DNA 含量分析和光散射分析。

四、常見問題及解答

Q1：是否可以直接用乙醇固定細胞?
A：不可以，直接 70～75% 乙醇加入很容易導(dǎo)致細胞聚團現(xiàn)象，很難重懸成單細胞，影響固定效果，其至容易導(dǎo)致固定后無細胞沉淀的現(xiàn)象。正確做法是: 待細胞, 充分分散成單細胞后，緩慢地滴入無水乙醇中，使其終濃度為 70～75%7 醇。

Q2：細胞量過少，無法獲得數(shù)據(jù)結(jié)果?
A：首先，要保證收集足夠的細胞樣品 (個人經(jīng)驗至少收集 100 萬左右): 如果藥物處理后。細胞死亡過多，應(yīng)該降低藥物濃度；其次，固定細胞時先用預(yù)冷的 PBS 重懸細胞，再逐滴滴入無水乙醇中；細胞清洗時，不可過度吹打細胞，以防產(chǎn)生過多的細胞碎片。最后，盡量采用尖底的離心管和水平的離心機，離心后盡量用移液槍吸走上清，不要傾倒，殘留一點，不要吸完。

Q3：什么樣的數(shù)據(jù)結(jié)果可以用?
A：G2/M 期細胞的 DNA 含量是 G1 期的 2 倍，在直方圖上形成一個 2 倍于 G1 信號峰的高斯峰；CV(變異系數(shù)) 表示峰的寬度，CV 值越小，峰形越好，最好是在 5% 左右，一般小于 10%
也被認可。RCS 最好是在 1～3，高于 5 則不被認可。RCS 高，說明數(shù)據(jù)的分布和軟件所建立模型的預(yù)期值的差別比較大，可能由于處理細胞的時候 RNA 酶消化不好，或者是 PI 的濃度不佳造成的。

Q4：如何提高分辨率和精確度?
A：變異系數(shù) (Coefficient of Variation，CV 值) 反映 G0/G1 峰分辨率和精確度。而樣品 CV 值為樣品固有，與樣本制備過程中細胞質(zhì)量有關(guān)。細胞碎片越少、細胞聚團越少、RNA 酶消化越充分，可以減少樣本的 CV 值，提高 G0/G1 峰分辨率和精確度。

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細胞凋亡檢測（Annexin V-FITC 雙染法）

一、實驗?zāi)康模?/strong>通過檢測處于凋亡狀態(tài)的細胞數(shù)量來檢驗?zāi)康幕蚺c細胞凋亡的關(guān)聯(lián)或者藥物對細胞凋亡的影響。

二、實驗原理：

在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸 (phosphotidylserine，PS) 位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡細胞中，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。

Annexin-Ⅴ能與 PS 高親和力結(jié)合?？赏ㄟ^細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。用標(biāo)記了 FITC 的 AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。細胞壞死的過程中也會發(fā)生細胞膜損傷，壞死的細胞會結(jié)合 Annexin V-FITC。

Annexin V-FITC 通常與細胞膜非滲透性核酸熒光染料聯(lián)合使用以檢測凋亡細胞。常用的染料是 PI。正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的，核酸染料 Propidium iodide(PI) 不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI 能夠透過細胞膜與細胞核結(jié)合呈現(xiàn)紅色。

將 AnnexinⅤ與 PI 匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。壞死細胞可以同時與 Annexin V-FITC 和 PI 結(jié)合顯色，而 PI 則被排除在活細胞 (FITC 陰性) 和早期凋亡細胞 (FITC 陽性) 之外。在沒有巨噬細胞的情況下，凋亡的最后階段會像細胞壞死一樣發(fā)生整個細胞的解體，從而使凋亡晚期的細胞也同時被 FITC 和 PI 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性。

五、細胞凋亡檢測（Annexin V-FITC 雙染法）實驗步驟

1. 待各實驗組 6 孔板細胞生長至覆蓋率約為 70% 時，收集上清，胰酶消化貼壁細胞，完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，與上清細胞收集于同一 5 mL 離心管中，每組設(shè)三個復(fù)孔 (為保證上機細胞數(shù)足夠，細胞數(shù)目 ≥ 5×10⁵/處理）。若為懸浮細胞，直接收集。

2.1000 g 離心 5 分鐘，棄上清，用 PBS 輕輕重懸細胞；

3.1000 g 離心 5 分鐘，棄上清，加入 195μl Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細胞。

4. 加入 5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。

5. 加入 10μl 碘化丙啶染色液，輕輕混勻。

6. 使用鋁箔進行避光，室溫 (20-25℃) 避光孵育 10-20 分鐘，孵育過程中重懸細胞 2-3 次，隨后置于冰浴中。

7. 立即上機檢測

四、常見問題及解答

Q1：構(gòu)建了慢病毒轉(zhuǎn)染的穩(wěn)轉(zhuǎn)株（帶綠色熒光），檢測凋亡使用 FITC 也是綠色熒光，是否會干擾？
A：會有干擾，可以換紅色熒光標(biāo)簽的試劑進行檢測。

Q2：鏡下觀察有很多漂浮細胞，可以看到凋亡，為什么染色后跑流式，凋亡比例跟 control 差不多？
A：將漂浮的細胞收集起來再進行實驗

Q3：Annexin V-FITC 和 PI 在激光共聚焦顯微鏡下分別選擇的測量波長是多少？
A：綠色熒光可以使用 488nm 激發(fā)，PI 是紅色熒光，使用 535nm 激發(fā)

Q4：FITC 和 PI 孵育時間過短，對結(jié)果有什么影響？
A：孵育時間過短，影響裝載效果，時間過長，也要考慮細胞本身的狀態(tài)。

Q5：想問一下用流氏檢測應(yīng)該怎么設(shè)門？
A：用陰性未染色的細胞調(diào)電壓，門設(shè)置，annexin V-FITC 單染、PI 單染來調(diào)補償。

來源：" Super Lab"公眾號 小編：red red sea
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